一、環(huán)境要求
PCR的特點決定了進行反應的唯一DNA必須是實驗者所加的模板，所以PCR應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。在醫(yī)學上，當診斷涉及倫理道德方面的疾病時，可能還會遇到糾紛和官司。在進行食品的轉(zhuǎn)基因成分檢測時，由于污染可能導致錯誤的檢測報告。
污染問題和進行無污染PCR所要求的潔凈度之間的關(guān)系被比喻成操作病原體與好的微生物技術(shù)之間的關(guān)系，與微生物技術(shù)不同的是，“生物危害”主要是對PCR而非操作者本人。因而這種干凈的環(huán)境是任何以PCR為基礎(chǔ)的分析系統(tǒng)所需要的，不管其處理的樣品數(shù)量如何。
二、污染的來源
PCR可從痕量的DNA擴增出大量的DNA產(chǎn)物使得PCR特別容易受到污染，主要是由于操作時產(chǎn)生氣溶膠而引起的。污染的DNA可能有3個來源：一是來自其它測試樣品的DNA；二是來自試驗材料如重組克隆的DNA；三是來自同一靶序列前一次PCR的擴增產(chǎn)物，這種污染通常稱為“遺留”污染，是最為麻煩的一種。
三、控制污染的方法
1.分區(qū)控制污染 把PCR實驗室的各部分在區(qū)域上分為樣品制備、前PCR區(qū)和后PCR區(qū)。在不同的地點進行PCR的目的是為了避免污染，即舊的PCR產(chǎn)物在對新的PCR分析的污染、分子克隆的污染和樣品與樣品之間的污染。將PCR過程的各部分在區(qū)域上分開需要額外的空間、資金和設(shè)備，但這一方法應該是任何污染控制策略的核心部分，必須進行資金等投入。
2.UNG控制污染使用尿嘧啶DNA-糖苷酶(UNG)，并用脫氧尿苷三磷酸(dUTP) 代替脫氧胸苷三磷酸(dUTP)。 其做法是將所有的擴增反應與UNG酶進行預反應，可以去除殘留在DNA中的dU(但不影響DNA、gUTP 或RNA)，產(chǎn)生數(shù)十或數(shù)百的無堿基位點，DNA聚合酶會在這些位點處停滯。而且這些位點是不穩(wěn)定的，在熱循環(huán)中會發(fā)生斷裂，每一種損傷都會防止重擴增的發(fā)生。PCR產(chǎn)物越長，UNG去污染的效率就越高，但對短于100bp的PCR產(chǎn)物不能用UNG完全消除污染。
3.紫外線控制污染用紫外線使干燥的DNA失活以減少器材表面模板DNA污染的手段，機理是通過在相鄰的嘧啶堿基之間形成環(huán)丁烷而造成DNA損傷，環(huán)丁烷環(huán)形成鏈內(nèi)的嘧啶二聚體，從而抑制了聚合酶介導的鏈延伸反應。其缺陷是不能消除所有污染，而只能將污染降低幾個數(shù)量級，并且當DNA片斷小于300bp時效果較差。另外象加樣器、離心機等器材只有一小部分是向著光源的，這樣就不能被紫外線有效地去除污染。因而，紫外線照射僅可以為保持PCR實驗室的無污染提供額外的安全保障。
四、PCR 實驗室各區(qū)的預防措施
1.樣品準備區(qū)這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準備，所有的樣品都帶進這個區(qū)域處理，以根據(jù)應用的需要提取DNA或RNA。在制備和操作用于核酸提取的試劑時應采取以下預防措施：
(1)實驗者在任何時候都應該穿實驗服和戴手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在DNA抽提過程中每1步之間都要更換。實驗服要專門用于樣品準備間，并經(jīng)常清洗；
(2)只要能夠得到可靠的結(jié)果，提取和純化模板的方法越簡單越好；
(3)要使用新鮮配制的或適當儲存的未使用過的試劑或緩沖液來提取核酸，不要用以前用于別的樣品的試劑；
(4)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列；
(5)DNA樣品應該用有專門防護或正活塞式加樣器，以防止在吸取樣品時有氣溶膠的產(chǎn)生遺留；
(6)大體積樣品應該用單獨包裝的無菌一次性加樣器吸?。?
(7) Eppendorf 管盡量用進口的，在打開之前都要經(jīng)短時離心(約10s)，并用正確的手法緩慢打開，而不能用力崩開，以減少和避免氣溶膠的產(chǎn)生；
(8) PCR產(chǎn)物和帶有擴增序列的DNA克隆不能在這個區(qū)域操作；
(9)最好在實驗臺上鋪設(shè)1次性臺布，用完后丟棄；
(10)實驗完畢應打開紫外線燈照射30min以上。
2.前PCR區(qū)此區(qū)域是專門用于準備各種反應的區(qū)域。
(1)如果實驗室內(nèi)部有合成引物或探針的能力，則引物的合成和純化都應在遠離PCR實驗室的其它專門區(qū)域進行；
(2)用于操作引物的加樣器應該是專用的并得到妥善保管。如引物被模板DNA污染，則這種污染不可能去掉，且經(jīng)濟損失也是較大的，并會導致假陽性的結(jié)果；
(3)此區(qū)域的實驗服是專用的，不能用于其它區(qū)域；
(4)如果是1個人負責全部的實驗，則實驗者不能從此區(qū)域重新回到樣品準備區(qū)，而只能從此區(qū)域到后PCR區(qū)作單方向的移動。
3.后PCR區(qū)
(1)此區(qū)域使用的所有試劑、一次性器材和儀器都必須是專門用于這一目的，絕不能用于任何前PCR活動的區(qū)域； .
(2)前PCR區(qū)與后PCR區(qū)應沒有試劑和人員的混雜，實驗者不能從此區(qū)域進人到前PCR區(qū)；
(3)在此區(qū)域建立適當?shù)呐棚L裝置看來是必要的；
(4) PCR儀的位置看來是個小問題，但該儀器如有包括進行污染非敏感型的多種用途，折衷的辦法是將儀器放在后PCR 區(qū)。
五、其它措施
1.保證高質(zhì)量的實驗用水 所有配制PCR試劑使用的水應該是新鮮蒸餾的去離子水，用0.22pm濾膜過濾的，并且經(jīng)高壓滅菌，儲存過久的水應避免使用，認為購買的蒸餾水是干凈的觀點是錯誤的。純水的制備應在沒有DNA污染的其他實驗室進行，如化學實驗室等。如果實驗室用水或純水機被污染，則對整個實驗是致命的。
2.手套的使用在配制試劑、操作樣品、建立反應和檢測擴增產(chǎn)物的全部過程中，都要戴手套并勤于更換，以避免核酸和核酸酶的污染；
3.正確的試劑配制與貯存使用的試劑應是“分析純”以上、正規(guī)廠家生產(chǎn)和從正規(guī)渠道購買的，以避免重金屬離子、核酸酶和其它非特異污染物的引入。所有的試劑應以大體積、高濃度(如10x、50x等)來配制，然后稀釋和分裝成僅夠一次使用的量進行貯存，以保證實驗的連續(xù)性和避免污染。
4.加樣器的妥善保管應準備多支加樣器以用于不同的PCR的操作，雖然這樣會增加成本投入，但卻是減少污染的有效辦法；樣品準備區(qū)和前PCR區(qū)使用的加樣器在不使用時，將其保存在密封袋中是防止加樣器污染的1種有效方法。
5.設(shè)立對照 應設(shè)立陽性、弱陽性和陰性對照。使用陽性對照時，應嚴格避免由對照引起的污染；使用弱陽性對照的目的是驗證各種反應緩沖液中含擴增抑制物；陰性對照則要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品和PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應包括除模板以外的所有試劑。
6.器材的處理所有試劑和樣品準備過程中都使用1次性滅菌的瓶子和管子。一些較貴重的需要復利用的器材，如玻璃器皿，必須經(jīng)強酸處理后，再經(jīng)170℃，2h的干烤處理。某些認為125℃高壓處理能夠破壞模板DNA的想法和做法是不可靠的。
7.風淋 的使用如果把組織培養(yǎng) 或微生物操作的標準無菌技術(shù)用于PCR，如風淋的使用，則污染的風險將大大降低，但這無疑要大大增加成本的投入。
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